Istraživanje učinka intraartikularne aplikacije autolognog masnog tkiva u oboljelih od osteoartritisa

Osteoartritis (OA) je degenerativna bolest zglobova u čijoj podlozi glavnu ulogu ima oštećenje zglobne (hijaline) hrskavice. Kao posljedica oštećenja hrskavice dolazi do preraspodjele opterećenja te karakterističnih promjena koje se očituju radiološki, a klasificiraju posebnim bodovnim sustavima. Značaj ove bolesti od neizmjerne je važnosti s obzirom da predstavlja jedan od vodećih uzroka invalidnosti u modernom svijetu.

S druge strane, hijalina hrskavica je avaskularna, aneuralna i alimfatična, a njena prehrana se odvija isključivo putem difuzije iz sinovijalne tekućine. Jedini period tijekom kojeg hijalina hrskavica dobiva hranu putem subhondralnih krvnih žila je u period njenog razvoja. Interakcija kolagenskih vlakana (prvenstveno kolagen tipa II) s proteoglikanima (molekule koje sadrže tzv. „core protein“ i glikozaminoglikane (GAG), točnije: hondroitin-sulfat, heparan-sulfat, dermatan sulfat i keratan sulfat) ima važnu ulogu u strukturnoj i mehaničkoj stabilnosti hijaline hrskavice. Ugrađivanje vode u makromolekule proteoglikana, te posljedično djelovanje molekula GAG koje stvaraju tzv. „swelling pressure“ doprinosi tzv. reverzibilnoj deformaciji zglobne hrskavice koja pri djelovanju sila ne mijenja svoj volumen. Početna oštećenja hrskavice, nažalost, ne dovode do nastanka boli, kako zbog nedostatka krvnih žila (nedostatak upalnog odgovora) tako i zbog nedostatka osjetnih živaca, što predstavlja ozbiljan klinički problem u prevenciji razvoja osteoartritisa (OA). No, s vremenom, progresija oštećenja hrskavice, prvenstveno stvaranjem erozija, točnije vertikalnih procjepa hrskavice,  dovodi do njene daljnje degeneracije, ali i nastajanja fragmenata hrskavice koji plutaju u sinovijalnoj tekućini, što u konačnici pokreće citokinski odgovor i nastanak upalne reakcije sinovijalne membrane zglobne čahure te stvaranje prvih kliničkih znakova upale, otoka i boli.  Prilikom gubitka pokrova hrskavice, dolazi do značajnog trenja površinskih slojeva subhondralnih kostiju koje su sada u međusobnom kontaktu, te posljedičnog nastajanja disfunkcije zgloba, tipično za osteoartritis (OA). S druge strane, kao posljedica oštećenja hrskavice dolazi do preraspodjele opterećenja, te nastajanja karakterističnih promjena koje se očituju radiološki. Liječenje OA, dugo se vremena temeljilo isključivo na liječenju boli i u najtežim slučajevima ugradnji totalne endoproteze. Nove spoznaje, posebice iz polja tkivnog inženjeringa i regenerativne medicine, daju nadu oboljelima od OA, a od posebnog su interesa istraživanja vezana uz učinak mezenhimalnih stromalnih/matičnih stanica (MSC) koje po definiciji u određenim laboratorijskim uvjetima in vitro mogu formirati koštano, hrskavično, masno ili mišićno tkivo. Zbog specifičnih svojstva MSC, a koja se očituju na mjestu ozljede (angiogenetski, antiapoptotički, protuupalni, imunomodulatorni učinci), a sve putem lučenja bioaktivnih faktora, potiče se učinak cijeljenja ili regeneracije oštećenog tkiva (1). Zbog njihovih posebnih svojstva koja se očituju na mjestu ozljede prvenstveno zbog lučenja niza bioaktivnih faktora, «otac» mezenhimalnih matičnih stanica Arnold Caplan, predlaže promjenu njihova naziva u «medicinal signaling cells».

U Specijalnoj bolnici Sv. Katarina, u suradnji s Genosom i Dječjom bolnicom Srebrnjak, provedene su četiri studije:

Vodeći se najsuvremenijim metodama dijagnostike i liječenja, u Specijalnoj bolnici Sv. Katarina provedena je prva klinička studija koja je uključivala terapeutski postupak primijenjen na 17 pacijenata s osteoartritisom koljena (2,3). Postupak je uključio lipoaspiraciju i fizikalnu manipulaciju masnog tkiva kojim se dobiva mikrofragmentirano masno tkivo koje sadrži stromalnu vaskularnu frakciju (SVF). Stromalna vaskularna frakcija obiluje brojnim stanicama, uključujući i MSC, pericite, endotelne progenitorske stanice, limfocite T, limfocite B, mastocite, makrofage i dr. Dobivena SVF sukladno načelima «point of care» odmah se aplicirala u zglobove s ciljem poticanja regenerativnih procesa u koštanom i hrskavičnom tkivu. Procjena stanja pacijenata radila se u različitim vremenskim intervalima: prije primjene terapije te tri, šest i dvanaest mjeseci nakon terapije. U procjenjivanju stanja koristila se vizualno-analogna skala (VAS) boli u mirovanju i kretanju, mjerenje CRP-a u krvi, MRI metoda oslikavanja hrskavice kontrastnim sredstvom (dGEMRIC) koja je indirektno prikazala količinu glikozaminoglikana (GAG) u hrskavici i profil glikozilacije IgG protutijela iz krvi i sinovijalne tekućine kao vrlo osjetljivi biomarker akutnih i kroničnih upala.

Druga studija je uključivala aplikaciju autolognog mikrofragmentiranog masnog tkiva sa stromalnom vaskularnom frakcijom (SVF) u 20 pacijenata s OA koljena nakon čega su praćeni klinički parametri učinkovitosti terapeutskog postupka kroz period od 12 mjeseci (4). Treća studija je kroz period od 24 mjeseca pratila učinak autolognog mikrofragmentiranog masnog tkiva na sintezu glikozaminoglikana hrskavice u 11 pacijenata (5). Četvrta studija je obuhvatila polikromatsku imunofenotipizaciju stanica stromalne vaskularne frakcije iz mikrofragmentiranog adipoznog tkiva i lipoaspirata pacijenata s osteoartritisom metodom protočne citometrije (6). U prve tri (kliničke) studije pacijenti oboljeli od OA su kategorizirani sukladno bodovnom sustavu Kellgren-Lawrence-ove metode, bodovanjem ICRS (eng. International Cartilage Repair Society Cartilage Lesion System) koristeći magnetsku rezonanciju, utvrđivanjem stupnja devijacije osovine donjih ekstremiteta te sukladno rezultatima dobivenih nakon kliničkog pregleda.

Rezultati prve studije, prvenstveno analizirajući vrijednosti glikozaminoglikana mjerenih dGEMRIC metodom ukazuju da intraartikularna aplikacija mikrofragmentiranog masnog tkiva dovela do statistički značajnog povećanja koncentracije GAG u više od pola provedenih mjerenja, dok je statistički značajan pad u koncentraciji GAG vidljiv u manje od 4% mjerenja. Sukladno tome, rezultati naše studije sugeriraju da primjena autolognog mikrofragmentiranog masnog tkiva sa stromalnom vaskularnom frakcijom kod pacijenata s OA dovodi do povećanja GAG u hijalinoj hrskavici što posljedično prati smanjenje boli te poboljšanje pokretljivosti promatranih pacijenata. Na mjestima potpuno uništene hrskavice, sukladno očekivanju nije bilo zabilježenih promjena vrijednosti glikozaminoglikana nakon primjene terapije. Moguće djelovanje mikrofragmentiranog masnog tkiva do objavljivanja našeg rada se tumačilo na više načina bilo da mikrofragmentirano masno tkivo samo postaje vezivno tkivo koje osigurava mehaničku potporu u području oštećene hrskavice, ili da stimulira proliferaciju hondrocita kao i proizvodnju izvanstaničnog matriksa i zaključno da na mjesto ozlijede doprema veliki broj MSC koji putem niza signalnih molekula omogućuju direktni regenerativni učinak na tkivo (7).  Rezultati naša studije govori u prilog treće varijante te da se putem parakrine sekrecije bioaktivnih faktora koje luče MSC uzrokuje pojačani odgovor hondrocita,. Naime tijekom studije, zabilježen je porast koncentracije GAG važnih za kvalitetu same hrskavice i to na mjestima gdje su prije primjene bili prisutni hondrociti. Na mjestima gdje početno nisu bili prisutni hondrociti nije došlo do povećanja razine GAG. Osim toga, tijekom studije nisu pronađene statistički značajne promjene udjela pojedinih N-glikana u analizi glikoma IgG-a u krvi i sinovijalnoj tekućini uzetima u različitim vremenskim intervalima. Rezultati analiza glikoma IgG-a iz krvi govore u prilog da je do porasta razine GAG došlo zbog lokalne primijene terapije, bez sustavne promjene profila IgG glikoma. Također, analiza N-glikanskog profila IgG-a iz krvi i sinovijalne tekućine dokazala je kako se primjenom ove terapije ne razvijaju lokalni i sustavni upalni odgovor.

 U drugoj studiji, 12 mjeseci nakon aplikacije mikrofragmentiranog masnog tkiva, pacijenti su detaljno obrađeni i evaluirani sukladno rezultatima dobivenim analizom upitnika WOMAC (engl. Western Ontario and McMaster Universities Osteoarthritis Index), KOOS (eng. Knee Osteoarthritis Scoring System) i VAS (engl. Visual Analogue Scale) upitnika.  Od 20 ispitanika, njih 17 pokazalo je statistički značajno poboljšanje kliničkog statusa u odnosu na početne rezultate (4).  Istodobno su koristeći MRI metodu oslikavanja hrskavice kontrastnim sredstvom dGEMRIC) (eng. Delayed Gadolinium-Enhanced Magnetic Resonance Imaging of Cartilage), analizirani rezultati 11 pacijenata (20 koljena), a koji su praćeni kroz period od 24 mjeseca. Ranije se pokazalo da je metoda oslikavanja hrskavice kontrastnim sredstvom dGEMRIC), a koja indirektno prikazuje količinu GAG u hrskavici iznimno osjetljiva u utvrđivanju promjene razine GAG nakon aplikacije mikrofragmentiranog masnog tkiva (2).  Zaključno, treća studija je pokazala da u 11 pacijenata (20 koljena) oboljelih od OA, koji su praćeni kroz periodu od 24 mjeseca utvrđeno je da je u većine pacijenata razina GAG (indirektno mjereći putem dGEMRIC indeksa) viša nego što je to bilo izmjereno na početku studije, a prije aplikacije mikrofragmentiranog masnog tkiva, što direktno sugerira da je učinak stanica koje se nalaze u SVF dugotrajan (5).

Reference:

1. Hudetz D, Jeleč Ž, Rod E, Borić I, Plečko M, Primorac D. The Future of Cartilage Repair. In: Personalized Medicine in Healthcare Systems: legal, Medical and Economic Implications. (Editors: Nada Bodiroga-Vukobrat, Daniel Rukavina, Krešimir Pavelić, Gerald G. Sander). Cham: Springer Nature Switzerland, Switzerland; 2019. p.375-411.
2. Hudetz D, Boric I, Rod E, Jeleč Ž, Radić A, Vrdoljak T, Skelin A, Lauc G, Trbojević Akmačić I, Plečko M, Polašek O, Primorac D. The Effect of Intra-articular Administration of Autologous Microfragmented Fat Tissue with Adipose-derived Mesenchymal Stem Cells on Proteoglycan Synthesis in Patients with Knee Osteoarthritis. Genes. 2017;8(10):270; doi:10.3390/genes8100270.
3. Rod E, Plečko M, Slišković AM, Borić I, Hudetz D, Jeleč Ž, Skelin A, Lauc G, Trbojević-Akmačić I, Polašek O, Vrdoljak T, Primorac D. Primjena mikro-fragmentiranog masnog tkiva sa stromalnom vaskularnom frakcijom u liječenju oštećenja zglobne hrskavice: Iskustva liječnika Specijalne bolnice Sv. Katarina. U :Molekularna genetika: novosti u dijagnostici i terapiji. (Urednici: Jadranka Sertić, Stjepan Gamulin, Filip Sedlić). Zagreb: Medicinska naklada; 2018. p. 28-48.
4. Hudetz D, Borić I, Rod E, Jeleč Ž, Kunovac B, Polašek O, Vrdoljak T, Plečko M, Skelin A, Polančec D, Zenić L, Primorac D. Early results of intra-articular micro-fragmented lipoaspirate treatment in patients with late stages knee osteoarthritis: a prospective study. Croat Med J. 2019 Jun 13;60(3):227-236.
5. Borić I, Hudetz D, Rod E, Jeleč Ž, Vrdoljak T, Skelin A, Polašek O, Plečko M, Trbojević-Akmačić, Lauc G, Primorac D. “A 24-Month Follow-Up Study of the Effect of Intra-Articular Injection of Autologous Microfragmented Fat Tissue on Proteoglycan Synthesis in Patients with Knee Osteoarthritis”. Genes (Basel) 2019, 10(12), 1051; https://doi.org/10.3390/genes10121051
6. Polancec D, Zenic L, Hudetz D, Boric I, Jelec Z, Rod E, Vrdoljak T, Skelin A, Plecko M, Turkalj M, Nogalo B, Primorac D. Immunophenotyping of a Stromal Vascular Fraction from Microfragmented Lipoaspirate Used in Osteoarthritis Cartilage Treatment and Its Lipoaspirate Counterpart. Genes (Basel). 2019 Jun 21;10(6). pii: E474. doi: 10.3390/genes10060474.
7. Bosetti M, Borrone A, Follenzi A, Messaggio F, Tremolada C, Cannas M. Human Lipoaspirate as Autologous Injectable Active Scaffold for One-Step Repair of Cartilage Defects. Cell Transplantation 2016:25;1043-56.